Die Ausgabe von 1539 umfasst sechs Kapitel, deren inhaltliche Anordnung gegenüber der Erstausgabe völlig verändert ist. Die ersten Kapitel behandeln zunächst Gott und den Menschen. Während das Denken Luthers um Jesus Christus kreist, steht bei Calvin Gott im Mittelpunkt. Die lateinische Formel Soli Deo Gloria (Gott allein sei Ehre) verdeutlicht diese Akzentsetzung. In den folgenden Kapiteln werden nacheinander abgehandelt : Gesetz, Glaubensbekenntnis, Buße, Rechtfertigung durch den Glauben, Zusammenhang zwischen Altem und Neuen Testament der Bibel und Prädestination (Vorbestimmung) - Providenz (Vorsehung).
Die Prädestinationslehre ist seitdem mit dem Namen Calvins verbunden. Er hat sie jedoch nicht selbst erfunden, sondern von Augustinus übernommen. Sie ist untrennbar mit der Lehre vom Heil ohne Verdienst verbunden. Für Calvin ist Gott die alleinige Quelle des Heils. Gott bestimmt die Erwählten und die Verworfenen. Die Prädestination ist für Calvin die logische Konsequenz eines Heils ohne Verdienst. Sie betont die Vorrangigkeit göttlichen Handelns.
Die folgenden Kapitel behandeln die Sakramente. Die Lehre vom Abendmahl ist nicht nur zwischen Katholiken und Protestanten ein Streitfall, sondern auch unter den Reformatoren selbst. Luther und Zwingli bekämpfen sich gegenseitig heftig in dieser Frage, auch wenn sie beide den katholischen Glaubenssatz von der Transsubstantiation ablehnen.
Zwingli geht von der geistigen ("symbolischen") Gegenwart Christi beim Abendmahl aus ; für Luther ist Jesus Christus wirklich in Brot und Wein zugegen.
Calvin bestreitet die körperliche Gegenwart Christi im Brot und im Wein. Für ihn ist Jesus Christus während des gemeinschaftlich begangenen Abendmahls im Glauben aller Beteiligten gegenwärtig.
Die letzten Kapitel behandeln jeweils die christliche Freiheit, die Macht der Kirche, die Macht der politischen Führung und das christliche Leben.
Calvin unterscheidet zwischen der kirchlichen und der politischen Macht. Er ist gegen die Einmischung der Obrigkeit in kirchliche Angelegenheiten. Im Gegensatz zu einer weit verbreiteten Meinung ist Genf im 16. Jahrhundert kein Gottesstaat gewesen (eine Herrschaftsform, bei der die Staatsgewalt allein religiös begründet wird). Dank der Lehre Calvins konnte die Kirche eine gewisse Eigenständigkeit gegenüber dem Staat bewahren, was sie selbst dann in Funktion erhielt, wenn sich dieser gegen sie stellte.
In seiner an Franz I. gerichteten Vorrede (Épître au Roi) der Unterweisung (die diesem gewidmet ist) schreibt Calvin :
Was hilft es dem Glauben mehr, als dass wir uns aller guten Dinge entblößt sehen, um von Gott bekleidet zu werden ? Aller Güter enteignet, um Ihn zu besitzen ? Sklaven der Sünde zu sein, um von Ihm erlöst zu werden ? Blind zu sein, um von Ihm erleuchtet zu werden ? Gebrechlich zu sein, um von Ihm aufgerichtet zu werden ? Schwach und schwankend zu sein, um von Ihm gestützt zu werden, uns allen Ruhms zu entledigen, um Ihn allein zu rühmen und uns in Ihm ?